免疫荧光法的注意事项

    免疫荧光技术又称荧光抗体技术，是标记免疫技术中发展zui早的一种。它是在免疫学、生物化学和显微镜技术的基础上建立起来的一项技术。
    免疫荧光技术按原理可分为直接法和间接法。所谓直接法就是将标记的特异性荧光抗体，直接加在抗原标本上，经过一定的温度和时间的染色，用水洗去未参加反应的多余荧光抗体，室温下干燥后封片、镜检。
    那么在进行直接免疫荧光法的操作时，有哪些是需要我们注意的呢？
    1.对荧光标记的抗体的稀释，要保证抗体的蛋白有一定的浓度，一般稀释度不应超过1:20，抗体浓度过低，会导致产生的荧光过弱，影响观察的结果;
    2.染色的温度和时间需要根据各种不同的标本及抗原的变化，染色时间可以从10min到数小时，一般30min已足够。染色温度多采用室温（25°C左右），高于37°C可加强染色效果，但对不耐热的抗原（如流行性乙型脑炎病毒）可采用0-2°C的低温，延长染色时间。低温染色过夜较37°C30min效果好的多;
    3.为了保证荧光染色的正确性，首次试验时需设置下述对照，以排除某些非特异性荧光染色的干扰。
    1)标本自发荧光对照：标本加1-2滴0.01mol/L,pH7.4的PBS;
    2)特异性对照（抑制试验）：标本加未标记的特异性抗体，再加荧光标记的特异性抗体;
    3)阳性对照：已知的阳性标本加荧光标记的特异性抗体。
    如果标本自发荧光对照和特异性对照呈无荧光或弱荧光，阳性对照和待检标本呈强荧光，则为特异性阳性染色。
    4.一般标本在高压汞灯下照射超过3min，就有荧光减弱现象，经荧光染色的标本zui好在当天观察，随着时间的延长，荧光强度会逐渐下降。
    间接法就是在检查位置抗原时，先用已知未标记的特异抗体（di一抗体）与抗原标本进行反应，用水洗去未反应的抗体，再用标记的抗体（第二抗体）与抗原标本反应，使之形成抗原-抗体-抗体复合物，再用水洗去未反应的标记抗体，干燥、封片后镜检。如果检查位置抗体，则表明抗原标本是已知的，待检血清为di一抗体，其他步骤的抗原检查相同。
    标记的抗体是抗球蛋白抗体，同于血清球蛋白有种的特异性，如免疫抗鸡血球蛋白只对鸡的球蛋白发生反应，因此，制备标记抗体适用于鸡任何抗原的诊断。
    操作间接免疫荧光法时我们应注意以下几点：
    1.荧光染色后一般在1h内完成观察，或于4°C保存4h，时间过长，会使荧光减弱;
    2.每次试验时，需设置以下三种对照：
    1)阳性对照：阳性血清+荧光标记物
    2)阴性对照：阴性血清+荧光标记物
    3)荧光标记物对照：PBS+荧光标记物
    3.已知抗原标本片需在操作的各个步骤中，始终保持湿润，避免干燥;
    4.所滴加的待检抗体标本或荧光标记物，应始终保持在已知抗原标本片上，避免因放置不平使液体流失，从而造成非特异性荧光染色。