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共聚焦和荧光显微镜快扫二者的区别

     共聚焦比荧光显微镜最大的优势是分辨率,但是很多人只把这个分辨率理解为空间分辨(x/y/z的分辨率)。其实,共聚焦分辨率高还有个方向,是指的它对弱荧光的分辨率。
    当我们连信号都采集不到的时候,空间分辨率对于我们来说就不重要了,这不是图像清不清楚的问题,而是采到采不到图像的问题。用于快扫的样品,大都满足两个条件:快速运动和荧光信号弱。快速运动限制了我们不能用常规共聚焦做,弱荧光限制了我们用显微镜不能实现。其实还有些其他因素促进了快速共聚焦的产生,比如说:共聚焦对于荧光染料的限制相对少些,快速运动的多通道荧光图像采集时,比荧光显微镜采集各通道之间的实时性要好等等。另外淬灭比显微镜要小(淬灭取决于单位面积上受到刺激的能量的大小和时间,虽然激光单位面积上的能量可能要大于汞灯,但是时间却小很多)。
快扫和高分辨率之间是矛盾的,常规的共聚焦都是点扫描,分辨率越高,扫描的点越多,出一张图速度自然会慢。在同样条件下,扫一个512×512的图肯定比1024×1024的时间要短。所以会出现线状针孔、尼科涅夫盘或者阵列针孔等共聚焦产品的出现,其实都是为了提高扫描的速度。
真正意义的共聚焦是指的是2个针孔保持共轭关系的状态下进行的点扫描。荧光显微镜检测弱荧光信号要比共聚焦强,至少是一样的(看是和哪种共聚焦比)。因为显微镜是一样的,而光路更简单,最后决定检测下限的因素只有检测器,所以荧光显微镜毫无疑问会更具有灵敏度优势。
    而快扫和常规扫描的差异不是512×512和1024×1024的扫描时间差异,关键是扫描方式不一样。如果抛开震镜精度区别(因为不知道有无差异),用同样的成像区域和象素数量,快速和常规扫描应该具有同样的空间分辨率。是因为使用同一个PNT,两者也应该具有同样的灵敏度。
    使用CSU NIPKOW共聚焦唯一的损失是低倍物镜(小于100倍)的Z轴分辨率,所以DSU具有可更换的碟片。而使用单碟片共聚焦除了Z轴分辨率的损失,还基本完全损失对弱荧光信号的检测能力。XY分辨率比单点共聚焦查了10%以上,这和物镜、CCD象素尺寸相关。

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